tailieunhanh - Các bước cơ bản của phương pháp tách dòng

Quá trình thực hiện có thể thay đổi phụ thuộc vào nhân tố tham gia và mục đích của quá trình tách dòng. Tuy nhiên để tạo dòng, cần phải thực hiện các bước sau: 1. Tách lập các DNA lạ cần tạo dòng Chọn và cắt DNA lạ của tế bào cho bằng một enzyme cắt hạn chế (RE). Phân lập đoạn DNA (gen quí) phù hợp với vector và mục đích cần tạo dòng. Trong trường hợp đặc biệt, để tạo dòng một gen chưa biết, người nghiên cứu có thể tổng hợp hóa học đoạn DNA cần tạo. | Các bước cơ bản của phương pháp tách dòng Quá trình thực hiện có thể thay đổi phụ thuộc vào nhân tố tham gia và mục đích của quá trình tách dòng. Tuy nhiên để tạo dòng cần phải thực hiện các bước sau 1. Tách lập các DNA lạ cần tạo dòng Chọn và cắt DNA lạ của tế bào cho bằng một enzyme cắt hạn chế RE . Phân lập đoạn DNA gen quí phù hợp với vector và mục đích cần tạo dòng. Trong trường hợp đặc biệt để tạo dòng một gen chưa biết người nghiên cứu có thể tổng hợp hóa học đoạn DNA cần tạo dòng khi dự đoán cấu trúc protein do gen chỉ huy tổng hợp hoặc tổng hợp cDNA từ mRNA. Tạo đầu dính khi cần thiết. 2. Chọn và xử lí vector Chọn vector cần phải chú ý những yêu cầu sau độ lớn của gen lạ đoạn cài loại tế bào chủ tiếp nhận vector và phương pháp ứng dụng. Xử lí vector cắt vector bằng enzyme cắt hạn chế cùng loại với enzyme đã cắt DNA nói trên để tạo những vết cắt giống nhau thuận tiện cho việc nối ghép sau này . Khử nhóm phosphat bằng enzyme alkanline phosphotase để tránh hai đầu vector đóng kín trở lại. 3. Tạo DNA tái tổ hợp Vector tái tổ hợp Việc tạo DNA tái tổ hợp bằng cách ghép DNA lạ vào vector đã được cắt cùng một enzyme cắt hạn chế loại II khi đó chúng sẽ ghép đôi những đầu dính lại với nhau nhờ bắt cặp bổ sung. Một phản ứng ghép nối xảy ra với sự có mặt của enzyme DNA ligase của E. Coli hoặc phage T4 để hoàn chỉnh phân tử lai. 4. Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ bằng phương pháp biến nạp hoặc tải nạp Công đoạn này nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp thành một số lượng lớn bản sao. Việc chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn tức là làm cho vi khuẩn trở thành khả biến nghĩa là có khả năng thấm vector tái tổ hợp. Sự thấm này có thể xảy ra một cách tự nhiên hoặc được cảm ứng. Tuy nhiên nó sẽ phụ thuộc vào loại plasmid sử dụng làm vector và phụ thuộc vào sự định vị của vùng cài lắp chứa bên trong vector mà người nghiên cứu sẽ chọn phương pháp biến nạp hoặc tải nạp. Biến nạp là hiện tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ .