tailieunhanh - Phương pháp tách RNA tổng số và mRNA

Tách RNA tổng số RNA được tiến hành chiết tách gồm các bước cơ bản tương tự như DNA (bao gồm phá vỡ màng tế bào, loại protein, tủa RNA) nhưng ở đây ta dùng enzyme desoxyribonuclease (DNase) để phân huỷ DNA. Do RNA kém bền và dể bị phân huỷ bởi enzyme ribonuclease (RNase) có nhiều ở khắp nơi, hoạt tính cao lại bền với nhiệt (trên 90°C), vì vậy, điều kiện thao tác để chiết tách phải được tiến hành trong môi trường vô cùng nghiêm ngặt. . | Phương pháp tách RNA tổng số và mRNA Tách RNA tổng số RNA được tiến hành chiết tách gồm các bước cơ bản tương tự như DNA bao gồm phá vỡ màng tế bào loại protein tủa RNA nhưng ở đây ta dùng enzyme desoxyribonuclease DNase để phân huỷ DNA. Do RNA kém bền và dể bị phân huỷ bởi enzyme ribonuclease RNase có nhiều ở khắp nơi hoạt tính cao lại bền với nhiệt trên 90 C vì vậy điều kiện thao tác để chiết tách phải được tiến hành trong môi trường vô cùng nghiêm ngặt. Phương pháp chung để tách RNA tổng số được tiến hành như sau - Tế bào được nghiền với chất tẩy rửa SDS sarcocyl nồng độ cao nitơ lỏng để biến tính protein. Đồng thời mẫu cũng được nghiền với chất khử 2-mercaptoethanol để ức chế RNase. Nước sử dụng cũng được xử lý với DEPC Diethylpyrocarbonat cũng để loại bỏ RNase. - Các protein DNA được loại bỏ qua xử lý mẫu với hỗn hợp dung môi Trizol phenol pH 4 guanidinium thiocyanate glycerol sodium acetate khi ly tâm ta tách được RNA trong pha nước. DNA ở pH 4 bị hấp phụ vào pha dưới cùng với phenol protein biến tính nằm giữa hai pha cũng bị loại cùng với DNA cùng với pha phenol. RNA trong pha nước được hút ra sau đó tủa bằng izopropanol để -20 C li tâm và rửa lại bàng ethalnol 79 thu hồi RNA tinh khiết bảo quản lạnh để làm các thí nghiệm tiếp theo. Chất lượng của RNA tổng số được đánh giá sơ bộ qua điện di trên gel agarose. Tách từng loại RNA khác nhau Dựa vào kích thước trọng lượng phân tử người ta có thể tiến hành sắc kí điện di hoặc ly tâm để tách từng loại RNA. Phương pháp tách mRNA Do kích thước bé lại chiếm lượng nhỏ R 5 RNA tổng số có cấu trúc đa dạng nên không thể tách bằng phương pháp trên. Nhờ đặc điểm mRNA có đuôi polyA do đó người ta tách mRNA ra khỏi mẫu bằng phương pháp sắc ký ái lực oligodt-xenlulose. Ngày nay trên thị trường có loại viên bi từ trên bề mặt có gắn oligodt. Sau khi mRNA bám trên bề mặt các viên bi từ thông qua liên kết bổ sung với oligodt các viên bi này thu nhận và đem ly tâm ta thu được mRNA tinh khiết. Lưu ý rằng để tách mRNA người ta đi từ