tailieunhanh - Ngân hàng cDNA

Thiết kế ngân hàng cDNA Ngân hàng cDNA là tập hợp các bản sao cDNA từ tất cả các mDNA của một tế bào. Như vậy, ngân hàng được thiết lập từ một loại tế bào xác định (tế bào biệt hóa), vì thế, cDNA mang tính tế bào rất cao. Quá trình chuẩn bị ngân hàng cDNA bao gồm các bước sau đây: | Ngân hàng cDNA 1. Thiết kế ngân hàng cDNA Ngân hàng cDNA là tập hợp các bản sao cDNA từ tất cả các mDNA của một tế bào. Như vậy ngân hàng được thiết lập từ một loại tế bào xác định tế bào biệt hóa vì thế cDNA mang tính tế bào rất cao. Quá trình chuẩn bị ngân hàng cDNA bao gồm các bước sau đây - Chiết tách RNA tổng số ta phải chọn những tế bào có chứa nhiều mRNA cần thiết và sau đó làm sạch mRNA. - Chọn lựa các mRNA chứa nhiều A polyA bằng cách tách trên cột xenlulose oligo dT. - Tổng hợp cDNA sợi kép đầu bằng từ mRNA dưới tác dụng của enzyme sao chép ngược nhờ kỹ thuật nuclease S1 hoặc kỹ thuật Gubler-Hoffman. - Metyl hóa các vùng hạn chế có trong đoạn cDNA sợi đôi được nhận biết bởi enzyme EcoRI để bảo vệ vùng này không bị cắt khi thao tác với EcoRI. - Tạo đầu dính bằng cách sử dụng đoạn nối linker có chứa trình tự nhận biết bởi EcoRI sau đó cắt bằng enzyme EcoRI. Trong trường hợp này chỉ có đoạn nối bị cắt còn cDNA vẫn còn nguyên vẹn do được metyl hóa . Đưa cDNA vào vector tạo DNA tái tổ hợp. - Ghép cDNA đầu dính vào vector thích hợp đã được mở EcoRI và đã khử nhóm phosphat - Hàn kín mạch nhờ enzyme phosphoryl hóa và enzyme ligase để tạo vector tái tổ hợp - Đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ và nuôi cấy trong các điều kiện thích hợp để tạo dòng - Xác định dòng cần tìm và thành lập ngân hàng cDNA. Mục đích của việc thiết lập ngân hàng cDNA là nhằm nghiên cứu sự biểu hiện của một gen xác định cùng với những vấn đề liên quan đến sự điều hòa biểu hiện gen cũng như mối tương tác giữa các gen trong một quá trình sống. Chú ý Khi phân tích kết quả thu được ngân hàng cDNA cần chú ý tác dụng sinh lí từng thời điểm thí nghiệm. 2. Sàng lọc ngân hàng cDNA Một phương pháp phổ biến nhằm sàng lọc ngân hàng cDNA được bắt đầu từ việc tạo canh trường nuôi cấy chứa đựng nhiều khuẩn lạc từ ngân hàng cDNA. DNA plasmid từ mỗi mẻ cấy vi khuẩn gắn với mảnh nhỏ nitro-xenlulose màng lai sẽ bị biến tính và lai với mRNA tổng số. Mỗi mRNA khác nhau sẽ được lai trên nitroxelulose với thứ tự