tailieunhanh - Chương 5: PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

DNA polymerase thực hiện tổng hợp mạch mới từ DNA mạch khuôn cần sự hiện diện của mồi chuyên biệt. Mồi: đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Nhiệt độ nóng chảy của mồi: Tm (ở nhiệt độ này, 50 % DNA mạch đôi bị tách mạch thành mạch đơn). Tm = 4(G + C) + 2(A + T) °C Nếu cung cấp 2 mồi chuyên biệt (mồi xuôi và mồi ngược) bắt cặp bổ sung với 2 đầu của một trình tự DNA, DNA polymerase sẽ xúc tác tổng hợp đoạn DNA nằm giữa 2 mồi | Chương 5 PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) Nguyên tắc của phương pháp PCR: DNA polymerase thực hiện tổng hợp mạch mới từ DNA mạch khuôn cần sự hiện diện của mồi chuyên biệt. Mồi: đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Nhiệt độ nóng chảy của mồi: Tm (ở nhiệt độ này, 50 % DNA mạch đôi bị tách mạch thành mạch đơn). Tm = 4(G + C) + 2(A + T) °C Nếu cung cấp 2 mồi chuyên biệt (mồi xuôi và mồi ngược) bắt cặp bổ sung với 2 đầu của một trình tự DNA, DNA polymerase sẽ xúc tác tổng hợp đoạn DNA nằm giữa 2 mồi. 2. Phản ứng PCR: Thành phần phản ứng: - DNA bản mẫu - Mồi xuôi và mồi ngược - dNTP (gồm 4 loại: dATP, dGTP, dTTP, dCTP) - MgCl2 - Enzyme polymerase (Taq polymerase, Pfu ) - Dung dịch đệm. - Nước cất 2 lần (đã khử trùng) Các bước của phản ứng: Là một chuỗi nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bước: Bước 1: Biến tính (denaturation) DNA được biến tính ở nhiệt độ cao, thường là 94 – 950C, trong thời gian 30s – 1 phút. Bước 2: Bắt cặp mồi (hybridization) Nhiệt độ cần cho sự bắt cặp mồi với DNA mạch khuôn là Ta (Ta thấp hơn Tm khoảng 50C). Bước 3: Kéo dài (elongation) Nhiệt độ được tăng lên đến 720C, để DNA polymerase hoạt động kéo dài mạch. 3. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR DNA mẫu: - DNA sạch, lượng DNA sử dụng cho PCR có khuynh hướng giảm (khoảng 100 ng) - Giảm lượng mẫu hạn chế sản phẩm “kí sinh”. - PCR có thể thực hiện trên các mẫu không được bảo quản tốt. Enzyme : Enzyme polymerase đầu tiên chịu nhiệt được tách chiết từ Thermus aquaticus là Taq polymerase. Enzyme Pfu DNA polymerase thu nhận từ vi khuẩn Pyroccus furiosus có khả năng chịu nhiệt cao hơn, có hoạt tính 3’-5’ exonuclease. Tth polymerase, tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng phiên mã ngược khi có RNA và Mn2+, khi có DNA và Mg2+ thì enzyme này thực hiện khuếch đại DNA. Mồi và nhiệt độ lai Ta - Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất, quyết định tính đặc hiệu của phản ứng. Khi thiết kế mồi cần chú ý: thành phần GC, khả năng bắt cặp bổ sung giữa “mồi xuôi” và “mồi ngược”, khả năng tạo cấu trúc “kẹp tóc”. Tm của 2 mồi không cách biệt quá xa. Mồi đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại và không bắt cặp với trình tự khác trên gen. Các thành phần khác của phản ứng: dNTP: thường sử dụng ở nồng độ là 20 -200 µM đối với mỗi loại. Mg2+: quá ít hiệu quả nhân bản giảm quá nhiều tạo sản phẩm không đặc hiệu Số lượng chu kỳ: không vượt quá 40 4. Ứng dụng của phương pháp PCR Tạo số lượng lớn bản sao DNA dòng hóa gene, giải trình tự, lập bản đồ di truyền, sản xuất mẫu dò Biến đổi một trình tự DNA: thêm vị trí của enzyme cắt hạn chế, gây tạo đột biến trên DNA, thêm trình tự promoter, trình tự gắn của ribosome 5. Hạn chế của phương pháp PCR Ngoại nhiễm: Xử lí: Khử trùng khu vực thao tác . Việc thiết lập phản ứng PCR và phân tích sản phẩm được tiến hành ở các khu vực khác nhau. Nhân bản không đặc hiệu: Các sai sót do Taq polymerase 5. Các dạng khác của PCR: RT –PCR (reverse transcriptase –PCR): RNA cDNA DNA. RT – PCR (Realtime PCR – PCR định lượng): xác định hàm lượng sản phẩm PCR tạo ra ở từng thời điểm. Nguyên tắc: xác định hàm lượng sản phẩm dựa trên tín hiệu huỳnh quang. PCR nested: sử dụng nhiều hơn một cặp mồi thu nhận sản phẩm đặc hiệu hơn.