tailieunhanh - KỸ THUẬT ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG DNA BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG PHỔ

Định lượng của các axit nucleic là thường được thực hiện để xác định nồng độ trung bình của DNA hoặc RNA có mặt trong hỗn hợp. | Đề tài Sinh học phân tử KỸ THUẬT ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG DNA BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG PHỔ Nguyễn Thị Xuân Thảo Nguyễn Thị Thúy Hằng Nguyễn Thị Mỹ Thuận Lê Thị Diệu Anh Phan Hoàng Yến Mai Văn Điểu Trần Văn Thảo Võ Hiệp NHÓM 12 ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG DNA Định lượng của các axit nucleic là thường được thực hiện để xác định nồng độ trung bình của DNA hoặc RNA có mặt trong hỗn hợp. Ứng dụng của phương pháp định tính, định lượng DNA được dùng nhiều nhất trong lĩnh vực y học như để chẩn đoán các bệnh học về di truyền PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG PHỔ Mục đích Nguyên tắc hoạt động Các yếu tố ảnh hưởng Mục đích Xác định hàm lượng và kiểm tra độ tinh khiết của phân tử DNA, ARN có trong dung dịch. Phương pháp đo quang phổ dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm của các base Purine và Pyrimidine, độ hấp thụ này tỷ lệ với nồng độ DNA. Nguyên tắc Dựa vào tính chất này mà người ta có thể xác định được hàm lượng các nucleic acid bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260nm (OD260nm – Optical Density260nm). Một đơn vị OD ở bước sóng 260nm ký hiệu là OD260nm. OD260nm = 50 g/ml cho một dung dịch DNA mạch kép OD260nm = 40 g/ml cho một dung dịch DNA mạch đơn hoặc RNA Độ hấp thụ ánh sáng của các base Công thức xác định hàm lượng DNA trong dung dịch DNA mạch đôi Hàm lượng ADN (µg/ml)= 50 x OD260nm x n Trong đó : OD260nm : độ hấp thụ của dung dịch DNA ở 260 nm 50: hệ số chuyển đổi của dung dịch có nồng độ DNA sợi đôi n: hệ số pha loãng DNA mạch đơn hay ARN Hàm lượng DNA (µg/ml)= 40 x OD260nm x n Trong đó : 40: hệ số chuyển đổi của dung dịch có nồng độ DNA sợi đơn. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ hấp thụ quang phổ PH Nhiệt độ Nồng độ ion Tạp chất protein Để đánh giá độ tinh sạch của dung dịch DNA, người ta còn đo dung dịch ở bước sóng 280nm là mức hấp thụ cực đại của protein, nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nm như các nucleic acid do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ acid nucleic. - Nếu tỉ lệ OD260nm/OD280nm = 1,8 – 2 thì có thể xem dịch chiết DNA là tinh sạch. Nếu tỉ lệ OD260nm/OD280nm > 2 thì dung dịch chiết RNA là tinh sạch, dung dịch DNA bị biến tính hoặc phân hủy. Nếu tỉ lệ OD260nm/OD280nm | Đề tài Sinh học phân tử KỸ THUẬT ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG DNA BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG PHỔ Nguyễn Thị Xuân Thảo Nguyễn Thị Thúy Hằng Nguyễn Thị Mỹ Thuận Lê Thị Diệu Anh Phan Hoàng Yến Mai Văn Điểu Trần Văn Thảo Võ Hiệp NHÓM 12 ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG DNA Định lượng của các axit nucleic là thường được thực hiện để xác định nồng độ trung bình của DNA hoặc RNA có mặt trong hỗn hợp. Ứng dụng của phương pháp định tính, định lượng DNA được dùng nhiều nhất trong lĩnh vực y học như để chẩn đoán các bệnh học về di truyền PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG PHỔ Mục đích Nguyên tắc hoạt động Các yếu tố ảnh hưởng Mục đích Xác định hàm lượng và kiểm tra độ tinh khiết của phân tử DNA, ARN có trong dung dịch. Phương pháp đo quang phổ dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm của các base Purine và Pyrimidine, độ hấp thụ này tỷ lệ với nồng độ DNA. Nguyên tắc Dựa vào tính chất này mà người ta có thể xác định được hàm lượng các nucleic acid bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260nm .