tailieunhanh - Giáo trình : Kỹ thuật nhân giống in vitro part 5

2. Chuyển gen trực tiếp bằng phương pháp điện di Nguyên tắc: Phương pháp chuyển gen trực tiếp vào mô thực vật bằng điện di do Ahokas(1989) đề xuất và Griesbach(1994) cải tiến. Mô thực vật, thường là đỉnh sinh trưởng, được đặt giữa 2 cực của một hệ điện di. DNA ngoại lai được hoà sẵn trong agarose, di chuyển theo điện trường xâm nhập vào mô thực vật(qua vách và màng tế bào) tiếp cận với bộ máy di truyền của tế bào, nhờ vậy gen ngoại lai được chuyển và biểu hiện. . | Lốp Cây trểny 49C - Nhóm 4 Công nghị sinh hnc. nàng nghiỊp 2. Chuyển gen trực tiếp bằng phương pháp điện di Nguyên tắc Phương pháp chuyển gen trực tiếp vào mô thực vật bằng điện di do Ahokas 1989 đề xuất và Griesbach 1994 cải tiến. Mô thực vật thường là đỉnh sinh trưởng được đặt giữa 2 cực của một hệ điện di. DNA ngoại lai được hoà sẵn trong agarose di chuyển theo điện trường xâm nhập vào mô thực vật qua vách và màng tế bào tiếp cận với bộ máy di truyền của tế bào nhờ vậy gen ngoại lai được chuyển và biểu hiện. Cải tiến quan trọng của Griesbach là toàn bộ quá trình chuyển gen được thực hiện trong điều kiện vô trùng hoàn toàn không cần thiết phải sử dụng các thao tác cấy mô tế bào thực vật. Quy trình 1. Protocorm kích thước khoảng 2mm chồi nách kích thước tương tự phôi hạt hay phôi soma có thể dùng để chuyển gen. 2. DNA ngoại lai hoà trong agarose đệm XTAE. Nồng độ DNA là 1mg ml. Khoảng 150ml hỗn hợp agarose - ADN đệm đã làm lỏng ở 100oC và để cho đóng rắn trong một ống micropipette. Ống này nối với cực âm của nguồn điện. Một ống micropipette tương tự được đổ 150pl hỗn hợp agarose - đệm nhưng không chứa ADN và nối với cực dương của nguồn điện. Phần trống còn lại của hai ống được nạp gần đầy bằng đệm X TAE. 3. Thời gian chuyển gen dưới 10 phút Cường độ dòng điện milliampe - milliampe cho đỉnh sinh trưởng hay 1 protocorm. 4. Rửa các cation tích luỹ với số lượng lớn ở đỉnh sinh trưởng hoặc protocorm bằng cách ngâm hoặc rửa một số lần trong nước cất sau khi kết thúc điện di. 5. Trường hợp protocorm và phôi soma cần giữ điều kiện vô trùng trong quá trình chuyển gen để sau đó tiếp tục nuôi cấy trên các môi trường chọn lọc tái sinh cây hoàn chỉnh. Trường hợp đỉnh sinh trưởng cây đang trồng trong chậu để đỉnh sinh trưởng lớn và theo dõi gen chuyển ở các lá hình thành sau đó hoặc các thế hệ sau. 3. Kỹ thuật sử dụng súng bắn gen Đây là phương pháp phổ biến được áp dụng thành công để chuyển gen trực tiếp vào thực vật. Nguyên tắc là phải tạo một luồng khí để