tailieunhanh - Luận văn : ĐỊNH DANH NẤM Trichoderma DỰA VÀO TRÌNH TỰ VÙNG ITS – rDNA VÀ VÙNG TEF part 2

Trong phản ứng PCR một chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên sẽ được lập đi lập lại nhiều chu kỳ và làm gia tăng số lượng DNA theo cấp số nhân. Sự khuếch đại này được tính như sau: Tổng số DNA khuếch đại= m x 2n . Trong đó: n là số chu kỳ thực hiện. m là số bản sao của chuỗi trình tự DNA cần nhân ra. Yếu tố quan trọng nhất trong phản ứng PCR là nhiệt độ nóng chảy của primer Tm. | 16 lượt được gắn vào mỗi đầu DNA khuôn sợi đơn gắn kế tiếp các nucleotid của primer và chiều bổ sung là 5 ở trên cả 2 DNA sợi đơn. Trong phản ứng PCR một chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên sẽ được lập đi lập lại nhiều chu kỳ và làm gia tăng số lượng DNA theo cấp số nhân. Sự khuếch đại này được tính như sau Tổng số DNA khuếch đại m x 2n . Trong đó - n là số chu kỳ thực hiện. - m là số bản sao của chuỗi trình tự DNA cần nhân ra. Yếu tố quan trọng nhất trong phản ứng PCR là nhiệt độ nóng chảy của primer Tm. Trong số 3 giai đoạn trên giai đoạn 2 quan trọng nhất bởi vì trong giai đoạn này sự lai DNA-DNA giữa primer và khuôn xảy ra. Nếu nhiệt độ chọn cho phản ứng quá thấp thì việc lai DNA sẽ bị nhiều lỗi. Nếu nhiệt độ chọn cho phản ứng quá cao thì không lai được DNA. Vì thế để thiết lập nhiệt độ cho phản ứng PCR người ta xác định nhiệt độ nóng chảy Tm với từng nhóm primer như sau Tm 4 x G X 2 A T 0C. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phản ứng PCR DNA khuôn DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật tinh sạch nhưng đôi khi kỹ thuật này cũng cho phép khuếch đại DNA thu được trực tiếp từ dịch trích tế bào mà vẫn cho kết quả tốt thông thường phương pháp này được áp dụng trong chẩn đoán. Lượng DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật nhỏ khoảng 1 ig. Nếu lượng DNA khuôn quá cao có thể tạo ra những sản phẩm phụ không như mong muốn hay còn gọi là dương tính giả. Enzyme DNA polymerase dùng trong phản ứng PCR phải là enzyme chịu nhiệt cao Taq polymerase được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus vi khuẩn suối nước nóng . 17 Taq polymerase quá cao chúng ta sẽ thấy hiện tượng tổng hợp DNA do phản ứng giả của primer trên dây đơn đây là những kết quả không chuyên tính sẽ làm sai lệch kết quả còn nếu nồng độ Taq polymerase quá thấp chúng ta sẽ không có đủ số lượng enzyme để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR theo ý muốn. Primer và nhiệt độ lai Primer có vai trò rất quan trọng trong tiến trình khuếch đại của phản ứng PCR. Việc thiết kế và chọn primer phải đáp ứng