tailieunhanh - Luận văn: NGHIÊN CỨU MỘT SỐ VIRUS TRÊN KHOAI TÂY (PVX, PVY, PLRV) TẠI ĐÀ LẠT BẰNG KỸ THUẬT ELISA, RT-PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ (part 5)

- Lượng RNA thích hợp cho phản ứng tổng hợp cDNA là 5 µl. Quy trình nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA phải thay đổi so với kit (tăng thời gian của giai đoạn 42oC từ 30 phút lên 40 phút). Chu kỳ nhiệt trong phản ứng tổng hợp cDNA 25oC trong 5 phút 42oC trong 40 phút 85oC trong 5 phút Giữ ở 4oC - Nồng độ hóa chất phù hợp hợp với quy trình đã nêu, kết quả thu đƣợc không có sự hiện diện của sản phẩm phụ. . | 32 cDNA - iScript cDNA kit . Kết quả thu đuợc ở lần chạy RT - PCR thứ 3 và có đuợc những thông số nhu sau Bảng Kết qủa thành phần hóa chất cho một phản ứng tổng hợp cDNA Thành phần Thể tích 5X iScript reaction Mix 4 pl Enzyme 1 pl RNA 5 pl Nuớc 10 pl - Luợng RNA thích hợp cho phản ứng tổng hợp cDNA là 5 pl. Quy trình nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA phải thay đổi so với kit tăng thời gian của giai đoạn 42oC từ 30 phút lên 40 phút . Chu kỳ nhiệt trong phản ứng tổng hợp cDNA 25oC trong 5 phút 42oC trong 40 phút 85oC trong 5 phút Giữ ở 4oC - Nồng độ hóa chất phù hợp hợp với quy trình đã nêu kết quả thu đuợc không có sự hiện diện của sản phẩm phụ. Luợng cDNA thích hợp cho phản ứng PCR là 5 pl. Bảng Kết qủa thành phần hóa chất trong một phản ứng khuếch đại cDNA Thành phần Nồng độ cuối Dung dịch đệm PCR 10X MgCl2 Hon hợp dNTP dNTP Mix Mồi xuôi sens primer Mồi nguợc antisens primer iTaq polymerase Nuớc 1X 1 mM 0 2 mM 0 3 pM 0 3 pM 1 U pl Cho vào để đủ 25 pl Tổng thể tích 25 pl - Kết quả cũng cho thấy quy trình nhiệt là ổn định. Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR - 94oC trong 5 phút - 94oC trong 1 phút - 50oC trong 1 phút 35 chu kỳ 33 - 72oC trong 1 phút - 72oC trong 10 phút Kết quả điện di 336bp Hình Kết quả điện di cDNA của virus PLRV L1 Thang DNA chuẩn 100 bp L2 L3 cDNA của mẫu 10 P12 L2 Nồng độ Taq polymerase 1 25 U L3 Nồng độ Taq polymerase 1 U - Do genome của PLRV không có đuôi poly A luợng cDNA chỉ đuợc tạo ra từ sự kéo dài các hexamer primer không có cDNA tạo ra từ primer oligo dT . Điều này chứng tỏ phản ứng PCR rất nhạy và hiệu quả khuếch đại rất cao. - Sản phẩm RT - PCR từ quy trình có sử dụng Taq của hãng Bio-rad cho kết quả rất chuẩn. Điều này đuợc chứng minh bằng kết quả giải trình tự có đuợc mà không cần tinh sạch sản phẩm RT-PCR. - Cặp primer đã sử dụng có độ đặc hiệu rất cao chỉ cho đúng 1 band ở vị trí 336 bp trên gel điện di. Điều này cho phép khẳng định mẫu này đã bị nhiễm virus PLRV. - Tuy nhiên kết quả trên vẫn còn chua thuyết phục lắm. .