tailieunhanh - Luận văn : Bước đầu đọc trình tự vùng rDNA-ITS của nấm Rhizoctonia solani Kuhn part 2

Hình 1: Lược đồ đọc trình tự của phương pháp Maxam và Gilbert Ưu điểm của phương pháp Trình tự có thể được xác định trên cơ sở bản đồ giới hạn (restriction). Trình tự có thể xác định được rất gần với vị trí đánh dấu. Khuyết điểm của phương pháp: Trình tự nhận được thường rất ít. Các phản ứng xảy ra chậm và độ tin cậy thấp. Phản ứng đòi hỏi nhiều hóa chất có tính chất ngẫu nhiên. . | Hình 1 Lược đồ đọc trình tự của phương pháp Maxam và Gilbert Ưu điểm của phương pháp J Trình tự có thể được xác định trên cơ sở bản đồ giới hạn restriction . J Trình tự có thể xác định được rất gần với vị trí đánh dấu. Khuyết điểm của phương pháp J Trình tự nhận được thường rất ít. J Các phản ứng xảy ra chậm và độ tin cậy thấp. J Phản ứng đòi hỏi nhiều hóa chất có tính chất ngẫu nhiên. J Hóa chất sử dụng cho phương pháp này rất độc hại cho người. . Phương pháp đọc chuỗi mã Sanger Sanger và cộng sự đã phát minh phương pháp giải trình tự bằng enzyme hay còn gọi là phương pháp dideoxynucleotide 1977 . Nguyên tắc cơ bản của phương pháp dideoxynucleotide dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA. Enzyme DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí đầu 3 -OH khi 11 gặp các nucleotide không có nhóm -OH dideoxynucleotide thì phản ứng tổng hợp bị dừng lại. Đặc trưng của phương pháp này là sử dụng dideoxynucleotide để làm ngừng các mạch đơn DNA đang được tổng hợp một các ngẫu nhiên. Thành phần của phản ứng sequencing cũng gần giống như thành phần trong một phản ứng PCR gồm 1 primer Taq polymerase dung dich đệm DNA khuôn và phần khác là dideoxynucleotide. Mỗi loại phản ứng được thực hiện riêng rẽ. Kết quả phản ứng tổng hợp nên các đoạn DNA dài ngắn khác nhau một nucleotide nhờ điện di trên gel polyacrylamide mà ta có thể phân biệt các đoạn này. ống phản ứng A ống phản ứng C ống phản ứng G ống phản ứng T ddNTP Reaction Mix dATP dCTP dTTP dGTP ddATP dATP dCTP dTTP dGTP ddCTP dATP dCTP dTTP dGTP ddGTP dATP dCTP dTTP dGTP ddTTP đoạn DNA cần giải trình tự 3 ----------CCTAT GGAATGC Primer sequencing sản phẩm -------- -------- -------- ---- --------- -------- Phóng xạ tự ghi sợi AND đơn tổng hợp trong mỗi ống phản ứng. Hình 2 Lược đồ phương pháp đọc trình tự của Sanger 12 Base OH H dNTP Khi một ddNTP mới được thêm vào để kéo dài chuỗi DNA thì sẽ không thêm vào được vì không có nhóm -OH. H H ddNTP Hình 3 Lược