tailieunhanh - Luân. văn : Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α part 5

phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) vortex đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C . Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 8: Cho vào mỗi eppendorf trên 300µl chloroform/isoamylalcohol, lắc đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C. Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 9: Thêm vào mỗi eppendorf trên 300µl isopropanol, ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 200c. Hút bỏ dịch nổi, thu kết tủa. Bƣớc 10: Rửa tủa trên bằng cách cho 500µl ethanol 70% lạnh vào mỗi eppendorf, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10. | Bước 7 Cho vào mồi eppendorf 300pl phenol chloroform isoamylalcohol 25 24 1 vortex đều ly tâm 10000 vòng phút trong 5 phút ở 200C . Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tương ứng. Bước 8 Cho vào mỗi eppendorf trên 300pl chloroform isoamylalcohol lắc đều ly tâm 10000 vòng phút trong 5 phút ở 200C. Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tương ứng. Bước 9 Thêm vào mỗi eppendorf trên 300pl isopropanol ly tâm 13000 vòng phút trong 20 phút ở 200c. Hút bỏ dịch nổi thu kết tủa. Bước 10 Rửa tủa trên bằng cách cho 500pl ethanol 70 lạnh vào mỗi eppendorf ly tâm 13000 vòng phút trong 10 phút ở 40C. Hút bỏ dịch nổi thu lấy kết tủa và làm khô bằng cách úp ngược trên giấy thấm. Bước 11 Cho 40pl TE vào mỗi eppendorf để hòa tan kết tủa. Bước 12 Hút 4pl chạy điện di trên agarose nồng độ trong 30 phút để xem kết quả chiết tách. Sau khi điện di kiểm tra sản phẩm chiết tách trên gel agarose thực hiện phản ứng cắt DNA plasmid tách chiết và DNA plasnid đối chứng. Thực hiện phản ứng cắt DNA plasmid và DNA plasmid đối chứng bằng enzym EcoRV sau đó kiểm chứng bằng cách điện di trên gel agarose sẽ cho biết DNA plasmid chiết tách được có phải là plasmid mà mình mong muốn hay không. Phản ứng cắt DNA Plasmid quy trình trích dẫn bởi Samuel 1994 Định nghĩa đơn vị enzym cắt Một đơn vị enzym cắt giới hạn là lượng enzym xúc tác phản ứng cắt hết một lượng DNA là 1pg trong buffer thích hợp trong thời gian là 1 giờ ở nhiệt độ thích hợp. Thực hiện phản ứng cắt với các thành phần như sau Buffer 10X DNA plasmid Enzym EcoRV Thêm nước cho tới 1hg 1 unit pl 25pl Ủ phản ứng ở 37oC trong 1 giờ biến tính enzym ở 65oC trong 15 phút Điện di 8pl sản phẩm cắt trên gel agrose với hiệu điện thế 100V trong 30 phút để kiểm tra. 33 Quy trình điện di trên gel agarose Chuẩn bị khuôn đổ gel gắn lược vào khuôn cân agarose cho vào chai chứa ml dung dịch TAE nấu agarose trong lò vi sóng trong 2 phút 650W. Để nguội đến 40-500C đổ gel vào khuôn khi gel nguội gỡ lược ra