tailieunhanh - Luân. văn : Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α part 2

trình tự MCS chứa các vị trí cắt giới hạn duy nhất (vẫn duy trì khung đọc) sẽ tạo thêm vài amino axit trong α-protein mà không ảnh hƣởng tới chức năng của lacZ. Các vector loại này sẽ đƣợc sử dụng với các chủng chủ thể hiện phần đầu carboxyl của βgalactosidase. Hiện tƣợng α-complementation xảy ra khi hai protein bất hoạt của βgalactosidase (α, ω-protein ) kết hợp với nhau để tạo thành một enzym có chức năng. Các khuẩn lạc có α-complementation sẽ dễ dàng đƣợc phát hiện vì việc xuất hiện khuẩn lạc màu xanh. | này trình tự MCS chứa các vị trí cắt giới hạn duy nhất vẫn duy trì khung đọc sẽ tạo thêm vài amino axit trong a-protein mà không ảnh huởng tới chức năng của lacZ. Các vector loại này sẽ đuợc sử dụng với các chủng chủ thể hiện phần đầu carboxyl của 0-galactosidase. Hiện tuợng a-complementation xảy ra khi hai protein bất hoạt của 0-galactosidase a ra-protein kết hợp với nhau để tạo thành một enzym có chức năng. Các khuẩn lạc có a-complementation sẽ dễ dàng đuợc phát hiện vì việc xuất hiện khuẩn lạc màu xanh trên môi truờng có chứa cơ chất tạo màu X-gal 5-Bromo- 4-chloro-3-Indolyl -0-D-galactopyranoside . Hợp chất không màu X-gal bị phân cắt bởi 0-galactosidase để cho galactose và một dẫn xuất của indoxyl. Dẫn xuất này đến luợt nó bị oxy hóa trong không khí để tạo ra dẫn xuất dibromo-dichloro có màu xanh. Để có sự biểu hiện của 0-galactosidase cần có chất kých hoạt là IPTG đồng phân của galactose không bị nhận biết bởi 0-galactosidase đóng vai trò nhu là chất kých hoạt của gen lacZ. Khi chèn đoạn DNA vào trình tự MCS của các vector ví dụ pBluescript sẽ làm ngăn cản việc tạo thành a-protein đầu amin. Do đó hiện tuợng a-complementation không thể xảy ra. Vì vậy khuẩn lạc do thể biến nạp hình thành có màu trắng. Chiết tách DNA plasmid Với mong muốn thu nhận một số luợng lớn các bản sao plasmid nguời ta sử dụng bộ máy di truyền của các tế bào chủ. Thông qua đó plasmid đuợc sao chép với số luợng lớn và tốc độ cực kì nhanh chóng theo tốc độ tăng truởng của tế bào chủ. Truớc hết biến nạp plasmid vào tế bào chủ sau đó nuôi cấy tế bào chủ trên môi truờng chọn lọc thích hợp thu nhận sinh khối tế bào. Quá trình tách chiết plasmid từ tế bào chủ là công đoạn cuối cùng nhằm thu nhận plasmid duới dạng tinh. Các quy trình tách chiết đều có các buớc chính là phá vỡ màng tế bào biến tính DNA tủa protein cuối cùng là tủa DNA. Tuỳ theo từng phuơng pháp cụ thể nguời ta sẽ sử dụng các tác nhân khác nhau trong từng công đoạn của quá trình tách chiết. Có nhiều phuơng pháp tách .