tailieunhanh - Lai ADN – Phần 1

Nguyên tắc được tiến hành như sau: ADN tổng số được tách ra và xử lý với enzym cắt hạn chế (có trường hợp không cần xử lý với enzym cắt hạn chế) sau đó điện di trên gel agarose và chuyển lên màng lai. Mẫu dò (probe) được chuẩn bị và lai với màng ADN ở trên. Kết quả phép lai cho biết sự khác biệt giữa các mẫu ADN khác nhau. Phép lai được tiến hành ở đây dựa vào cấu trúc sợi đôi ADN từ hai sợi đơn với các cầu liên kết hydrogene theo nguyên tắc. | Lai ADN - Phần 1 Nguyên tắc được tiến hành như sau ADN tổng số được tách ra và xử lý với enzym cắt hạn chế có trường hợp không cần xử lý với enzym cắt hạn chế sau đó điện di trên gel agarose và chuyển lên màng lai. Mẫu dò probe được chuẩn bị và lai với màng ADN ở trên. Kết quả phép lai cho biết sự khác biệt giữa các mẫu ADN khác nhau. Phép lai được tiến hành ở đây dựa vào cấu trúc sợi đôi ADN từ hai sợi đơn với các cầu liên kết hydrogene theo nguyên tắc bổ sung. Bắt đầu là đứt gãy các liên kết hydrogene do hoá chất kiềm hay biến tính nhiệt lúc này hai sợi đơn ADN tách nhau được gọi là trạng thái biến tính ADN denature . Nếu tại thời điểm này người ta cho vào một ADN đánh dấu biến tính mẫu dò sau đó tạo điều kiện hồi biến xuất hiện renature lúc đó sẽ cho phép các sợi đơn của mẫu dò bắt cặp với các sợi đơn của mẫu ADN ban đầu target ADN . Mức độ lai sẽ phụ thuộc vào tính đặc hiệu sự tương đồng giữa mẫu dò và mẫu gốc cũng như điều kiện cho phép lai thực hiện nhiệt độ nồng độ muối pH tỷ lện mẫu dò kích thước mẫu dò . Như vậy việc chọn điều kiện chính xác cho phép lai có ý nghĩa rất quan trọng cho tính đặc hiệu của kết quả phép lai. Sau khi lai bước tiếp theo là rửa bằng đệm thích hợp để loại mẫu dò dư và cuối cùng là phép đo bức xạ đánh dấu tuỳ theo phương pháp đánh dấu phóng xạ hay hoá chất phát xạ huỳnh quang để đánh giá mức độ tương đồng của phép lai. Nói tóm lại một số nhân tố tham gia vào kết quả của phép lai là mẫu dò ADN phương pháp đánh dấu ADN mẫu ADN lai và điều kiện tiến hành và phương pháp đánh giá kết quả phép lai. Chọn mẫu dò Việc chọn mẫu dò có ý nghĩa quan trọng cho phép lai. Nhìn chung các nhà phân loại học vi sinh vật thường không trực tiếp thiết kế mẫu dò. Về mặt này chúng tôi đưa ra một số nội dung chủ yếu về tiêu chí chọn mẫu dò theo Stahl và Amann 1991 như sau Mẫu dò sẽ lai với ADN đích target và không lai với các nguồn ADN khác có mặt trong mẫu lai. Khi phân tích các mẫu vi sinh vật với nhau thì mẫu dò nên là đoạn nucleotid đặc trưng cho các mẫu