tailieunhanh - KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ part 3

35 ống nuôi cấy. . Phương pháp điều chế dịch phage dung khuẩn 1) Dùng tăm (hoặc đầu pipet) vô trùng lấy một plaque duy nhất đã sàng lọc được genomic liabrary hoặc cDNA liabrary khuấy vào 100 µl môi trường SM. Môi trường SM chứa 5,8 g NaCl, 2,0 g , 25 ml Tris-HCl 2M (pH 7,5), 5 ml gelatin 2%, thêm nước cho đủ 1 lít, hấp cao áp tiệt trùng. 2) Để một giờ ở nhiệt độ phòng. 3) Cho vào 20 µl vi khuẩn đã bồi dưỡng qua đêm, để 15 phút ở 37 ºC. 4). | 35 ống nuôi cấy. . Phương pháp điều chế dịch phage dung khuẩn 1 Dùng tăm hoặc đầu pipet vô trùng lấy một plaque duy nhất đã sàng lọc được genomic liabrary hoặc cDNA liabrary khuấy vào 100 Ul môi trường SM. Môi trường SM chứa 5 8 g NaCl 2 0 g 25 ml Tris-HCl 2M pH 7 5 5 ml gelatin 2 thêm nước cho đủ 1 lít hấp cao áp tiệt trùng. 2 Để một giờ ở nhiệt độ phòng. 3 Cho vào 20 pl vi khuẩn đã bồi dưỡng qua đêm để 15 phút ở 37 C. 4 Thêm 5 ml môi trường NZYM bồi dưỡng qua đêm ở 37 C. Cuối cùng môi trường trở nên trong mặc dù không hoàn toàn và quan sát thấy các mẫu cặn phân giải của vi khuẩn. Môi trường NZYM chứa 10 0 g NZ amine 5 0 g NaCl 5 0 g cao nấm men yeast extract 2 0 g chế thêm nước cất cho đủ 1 lít hấp cao áp tiệt trùng. 5 Thêm 100 11 chloroform trộn đảo 15 phút. 6 Quay li tâm v ph trong vòng 10 phút hút lấy nước mặt dịch phage dung khuẩn chuyển qua ống khác. 7 Với phương pháp này có thể thu được phage với hiệu giá cao đến 1010 pfu ml. . Điều chế lượng nhỏ DNA phage 1 Thêm vào dịch phage dung khuẩn thu được ở 7 mục trên 5 U g ml DNase I và 5 Lig ml RNase A ủ 30 phút ở 37 C. 2 Thêm dung dịch PEG 6000 20 - NaCl 2M đến mức 10 so với tổng thể tích trộn rồi để trên nước đá 1 giờ. Polyethylene glycol 6000 gây kết tủa DNA. Dung dịch PEG 6000 20 - NaCl 2M chứa 20 polyethylene glycol 6000 và 2 mol lít NaCl so với thể tích toàn bộ. 3 Quay li tâm v ph 20 phút ở 4 C loại bỏ hoàn toàn nước mặt. 4 Thêm 0 5 ml SM vào cặn tạo huyền phù rồi chuyển sang ống Eppendorf. 36 5 Quay li tâm v ph trong 2 phút chuyển lớp mặt sang ống Eppendorf mới. 6 Thêm EDTA 10mM và SDS 10mM cho đủ 0 1 mỗi loại ủ ở 60 - 65 C trong 15 phút. 7 Thực hiện một lần chiết xuất bằng phenol phenol-chloroform rồi bằng chloroform. 8 Kết tủa DNA bằng cách cho thêm vào lớp nước còn lại một lượng tương đương isopropanol trộn rồi để 10 phút ở -70 C. 9 Quay li tâm v ph trong 5 phút loại bỏ lớp mặt. 10 Tráng cặn DNA bằng ethanol 70 làm khô. 11 Hòa tan vào 50 pl TE hoặc .