tailieunhanh - Định enotyp và phát hiện đột biến YMDD kháng lamivudine của HBV bằng kỹ thuật giải trình tự vùng gene rt của HBV

Đặt vấn đề: Thất bại trong điều trị nhiễm HBV bằng lamivudine là do virus có đột biến gần và/hay ngay tại YMDD chính là vị trí tác động thuốc trên gene polymerase của HBV. Có 4 đột biến giúp HBV kháng lamuvidine đã được chứng minh; đó là rtV173L, rtL180M, rtM204I/V, và rtV207I. Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng kỹ thuật giải trình tự để định genotype HBV và phát hiện đột biến YMDD kháng lamivudine của HBV. | ) được thiết kế bằng phần mềm Primer premier đặc hiệu đọan DNA nêu trên. Mồi được cho vào PCR mix với hàm lượng 15pm cho một PCR mix. Thực hiện PCR theo chu kỳ nhiệt như sau: 1 chu kỳ 95oC trong 5 phút; sau đó là 40 chu kỳ 94oC trong 30 giây, 55oC trong 30 giây và 72oC trong 1 phút; và cuối cùng là 1 chu kỳ 72oC trong 7 phút. Sau khi hòan tất PCR, phát hiện sản phẩm khuếch đại bằng điện di trong thạch . Sau khi điện di và xác định có sản phẩm khuếch đại đặc hiệu dài 567bp, sản phẩm PCR được tinh sạch bằng với bộ thử nghiệm tinh sạch sản phẩm PCR (PCR clean-up kit) do Promega sản xuất (Cat. #A9281). Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được định lượng nồng độ DNA bằng máy Genquant của Pharmacia. Sau đó, thực hiện phản ứng giải trình tự sản phẩm PCR đã tinh sạch và xác định nồng độ ở trên với PCR sequencing mix của Becman (DTCS: Dye Terminator Cycle Sequencing) với primer 827R. Sản phẩm giải trình tự được làm tủa và tinh sạch bằng phương pháp tủa với ethanol. Cuối cùng thực hiện giải trình tự trên máy sequencer CEQ8000 của Becman Coulter. Kết quả giải trình tự được phân tích trên chức năng analysis của CEQ8000 có chọn thêm thông số heterozygote. Sau đó dùng chức năng investigator của CEQ8000 để thực hiện đối chiếu so sánh trình tự giải được với trình tự tham chiếu được thành lập từ trình tự của gene polymerase