tailieunhanh - Thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật - Bài 6

Nuôi cấy protoplast I. Mục đích và yêu cầu Kỹ thuật protoplast phát triển mạnh từ sau công trình của Takebe (1971) khi tái sinh cây hoàn chỉnh từ protoplast của lá cây thuốc lá. Có ba phương thức phân lập protoplast, đó là: - Cơ học (không dùng các enzyme) - Sử dụng ezyme tuần tự (xử lý qua hai bước) - Sử dụng hỗn hợp enzyme (xử lý đồng thời) Tùy theo đối tượng và từng loại mô mà thay đổi nồng độ của các enzyme cho thích hợp. Vì proplast thực chất là tế bào trần không có. | 181 Bài 6 Nuôi cấy protoplast I. Mục đích và yêu cầu Kỹ thuật protoplast phát triển mạnh từ sau công trình của Takebe 1971 khi tái sinh cây hoàn chỉnh từ protoplast của lá cây thuốc lá. Có ba phương thức phân lập protoplast đó là - Cơ học không dùng các enzyme - Sử dụng ezyme tuần tự xử lý qua hai bước - Sử dụng hỗn hợp enzyme xử lý đồng thời Tùy theo đối tượng và từng loại mô mà thay đổi nồng độ của các enzyme cho thích hợp. Vì proplast thực chất là tế bào trần không có thành cho nên có thể tách được từ nhiều nguồn khác nhau như các bộ phận của cây lá rễ hạt phấn mô sẹo tế bào đơn. Protoplast thực vật có ba ứng dụng chính sau - Chọn dòng tế bào biến dị soma. - Dung hợp protoplast để lai vô tính tế bào thực vật. - Biến nạp di truyền đưa các cơ quan tử virus và DNA ngoại lai vào tế bào thực vật. II. Dụng cụ thiết bị hóa chất 1. Dụng cụ - Bình tam giác 100 mL đĩa petri nhựa đã vô trùng disposable - Giấy thấm vô trùng - Forceps kéo dao mổ - Đĩa petri thủy tinh vô trùng - Giấy parafilm giấy nhôm - Tube ly tâm loại 15 mL - Lưới lọc có đường kính lỗ lọc 65pm - Cốc chịu nhiệt ống đong micropipette 2. Thiết bị - Nồi khử trùng 182 - Tủ sấy - Laminar - Tủ lạnh - Micro wave - Cân phân tích 10-4g - Cân kỹ thuật 10-2g - Máy cất nước 2 lần - Máy ly tâm tốc độ 6000-10000 rpm rotor cho tube 15 mL - Máy lắc - Buồng đếm - Kính hiển vi đảo ngược 3. Hóa chất - Dung dịch enzyme tách protoplast - Môi trường phân lập PI môi trường nuôi cấy protoplast PC - Cồn 90 - Nước cất vô trùng III. Phương pháp tiến hành 1. Nguyên liệu thực vật Lá của cây thuốc lá in vitro được chọn dùng làm nguyên liệu tách protoplast. Sử dụng các lá được tách trong ngày. 2. Chuẩn bị môi trường Dung dịch enzyme tách protoplast Onozuka cellulase R10 0 5 Onozuka macerozyme R10 0 1 Mannitol 13 0 pHmôi trường 5 8 Dung dịch này được khử trùng bằng màng lọc Millipore loại có đường kính lỗ lọc 0 2-0 25 pm. 3. Tiến hành 183 a. Ngày thứ nhất Các mẫu lá thuốc lá in vitro được loại bỏ hết gân lá và đặt lên đĩa petri thủy tinh