tailieunhanh - Polymerase Chain Reaction - Các vấn đề cơ bản

PRC là thử nghiệm nhân bản một đoạn DNA trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt. Thử nghiệm được thực hiện trong một ống nghiệm nhỏ chứa dung dịch phản ứng (gọi là PCR mix) có thể tích vào khoảng từ 10 - 15 ml với các thành phần chủ yếu: enzyme polymerase chịu nhiệt, thường được gọi là Taq polymerase | Polymerase Chain Reaction Các vấn đề cơ bản PCR là gì PCR là thử nghiệm nhân bản một đoạn DNA trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt. Thử nghiệm được thực hiện trong một ống nghiệm nhỏ chứa dung dịch phản ứng gọi là PCR mix có thể tích vào khoảng từ 10pl đến 50pl với các thành phần chủ yếu là 1 enzyme polymerase chịu nhiệt thường được gọi là Taq polymerase có hoạt tính tối đa ở 72oC và bền được với nhiệt độ 2 4 loại desoxyribonucleotide dNTP là Adenine Thymine Guanine và Cytosine dATP dTTP dGTP và dCTP 3 DNA chứa các đoạn DNA đích sẽ được nhân bản trong ống phản ứng 4 các đoạn mồi primer xuôi và ngược là các đoạn oligonucleotide có chiều dài khoảng 20 - 30 nucleotide có trình tự bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của 2 đầu đoạn DNA sẽ được nhân bản 5 ion Mg trong muối MgCl2 ở nồng độ thích hợp 6 dung dịch đệm Tris-KCl để làm dung môi thích hợp cho phản ứng. Khi ống nghiệm phản ứng này được cho vào buồng ủ chu kỳ nhiệt của máy luân nhiệt thermal cycler mà chúng ta thường gọi là máy PCR chương trình nhiệt độ trong máy sẽ làm cho nhiệt độ trong buồng ủ nhiệt của máy thay đổi theo chu kỳ nhờ vậy mà phản ứng nhân bản DNA sẽ xảy ra. Nguyên tắc của PCR về mặt nguyên tắc một chu kỳ nhiệt độ sẽ bao gồm 3 giai đoạn nhiệt độ hình 1 1 Đầu tiên nhiệt độ sẽ được đưa lên 94oC ở nhiệt độ này các liên kết hydro của mạch đôi DNA sẽ bị mất đi nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành 94 C Biến tính 55oC-65oC Bắt cặp 72oC Kéo dài Chu kỳ Chu kỳ 2 Chu kỳ 3 Chu kỳ 4 các mạch đơn giai đoạn Hình 1 Nguyên tắc của PCR là nhân bản DNA đích qua các chu kỳ nhiệt 9 nhiệt độ này được gọi là giai đoạn biến tính. 2 Kế đó nhiệt độ sẽ được hạ đến 55oC-65oC là nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích giai đoạn nhiệt độ này được gọi là giai đoạn bắt cặp. 3 Cuối cùng nhiệt độ được đưa lên 72oC là nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của enzyme Taq polymerase để kéo các dNTP lại đầu 3 của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5 của sợi DNA đích để bắt nguồn cho sự .