tailieunhanh - PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ

Tham khảo tài liệu 'phương pháp lai phân tử', tài liệu phổ thông, sinh học phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả | Chương 6 PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ KHÁI NiỆM LAI PHÂN TỬ Khi 2 mạch DNA tách rời, nhiệt độ được làm giảm từ từ, cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, hai mạch sẽ bắt cặp trở lai. Đặc điểm: Đặc hiệu tuyệt đối: Sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa 2 trình tự hoàn toàn bổ sung với nhau. Các trình tự bổ sung có thể là DNA hoặc RNA hình thành các phân tử DNA-DNA, RNA-RNA, hoặc phân tử lai DNA-RNA. Các yếu tố ảnh hưởng đến lai phân tử. Nồng độ DNA và thời gian phản ứng: Ở nhiệt độ nhất định, số lượng các trình tự bổ sung càng nhiều thì xác suất bắt cặp càng tăng. Thời gian phản ứng càng dài, xác suất bắt cặp càng lớn, đồng thời số lượng phân tử lai tăng dần. Nhiệt độ Tốc độ phản ứng lai phụ thuộc nhiệt độ. Thông thường tốc độ phản ứng lai cực đại ở nhiệt độ thấp hơn Tm khoảng 25 %. Độ dài các trình tự Tốc độ lai tăng tỉ lệ thuận với căn bình phương của độ dài các trình tự bổ sung. Lực ion Nồng độ NaCl 1M làm tăng tốc độ phản ứng tăng lên từ 5 đến 10 lần. Nồng độ NaCl vượt quá 1,2 M hoàn toàn không có tác dụng. 3. Kĩ thuật Southern Blot Phương pháp này được sử dụng để định vị những trình tự đặc biệt trên DNA bộ gene, hay những DNA kích thước nhỏ hơn DNA plasmid, phage Cơ sở : kĩ thuật chuyển DNA từ gel lên màng lai. Đầu tiên, DNA được phân tách trên gel agarose và được tách thành dây đơn (sử dụng muối có nồng độ cao để biến tính) để chuyển từ gel lên màng lai. Cách tiến hành: - DNA bộ gene được cắt thành những đoạn có kích thước khác nhau bởi enzyme cắt giới hạn điện di để phân tách. - DNA được biến tính ngay trên gel chuyển lên màng lai (vị trí các đoạn DNA được giữ nguyên). - Tiến hành lai với mẫu dò có đánh dấu (phóng xạ, hóa học ) - Tiến hành rửa loại bỏ mẫu dò không bắt cặp đặc hiệu - Phát hiện tín hiệu lai. Ứng dụng: - Lập bản đồ giới hạn của gene - Phát hiện các đột biến mất đoạn, đột biến điểm trên gene. Kĩ thuật Southern blot 4. Kĩ thuật Northern blot. Phương pháp này được sử dụng để xác định kích thước và hàm lượng của một mRNA đặc trưng trong một hỗn hợp . | Chương 6 PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ KHÁI NiỆM LAI PHÂN TỬ Khi 2 mạch DNA tách rời, nhiệt độ được làm giảm từ từ, cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, hai mạch sẽ bắt cặp trở lai. Đặc điểm: Đặc hiệu tuyệt đối: Sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa 2 trình tự hoàn toàn bổ sung với nhau. Các trình tự bổ sung có thể là DNA hoặc RNA hình thành các phân tử DNA-DNA, RNA-RNA, hoặc phân tử lai DNA-RNA. Các yếu tố ảnh hưởng đến lai phân tử. Nồng độ DNA và thời gian phản ứng: Ở nhiệt độ nhất định, số lượng các trình tự bổ sung càng nhiều thì xác suất bắt cặp càng tăng. Thời gian phản ứng càng dài, xác suất bắt cặp càng lớn, đồng thời số lượng phân tử lai tăng dần. Nhiệt độ Tốc độ phản ứng lai phụ thuộc nhiệt độ. Thông thường tốc độ phản ứng lai cực đại ở nhiệt độ thấp hơn Tm khoảng 25 %. Độ dài các trình tự Tốc độ lai tăng tỉ lệ thuận với căn bình phương của độ dài các trình tự bổ sung. Lực ion Nồng độ NaCl 1M làm tăng tốc độ phản ứng tăng lên từ 5 đến 10 lần. Nồng độ NaCl vượt quá 1,2 M hoàn toàn .