tailieunhanh - Chương 6: Tạo dòng và xây dựng thư viện cDNA

Các phân tử RNA không bền, dễ bị phân hủy bởi các ribonuclease (RNase). Để thu được dịch chiết RNA có chất lượng tốt, cần phải giảm thiểu hoạt tính của RNase được giải phóng trong suốt quá trình sinh tan tế bào hoặc từ các nguồn tiềm tàng khác trong phòng thí nghiệm (dụng cụ, bàn làm việc, bàn tay của kỹ thuật viên.) bằng các nhân tố ức chế RNase, bao gồm các nhân tố ức chế protein của RNase, các phức hợp vanadyl-ribonucleoside hoặc macaloid. . | Chương 6 Tạo dòng và xây dựng thư viện cDNA I. Tách chiết tinh sạch và phân tích RNA 1. Tách chiết và tinh sạch RNA . Tách chiết RNA tổng số - Kiểm soát hoạt tính ribonuclease. Các phân tử RNA không bền dễ bị phân hủy bởi các ribonuclease RNase . Để thu được dịch chiết RNA có chất lượng tốt cần phải giảm thiểu hoạt tính của RNase được giải phóng trong suốt quá trình sinh tan tế bào hoặc từ các nguồn tiềm tàng khác trong phòng thí nghiệm dụng cụ bàn làm việc bàn tay của kỹ thuật viên. bằng các nhân tố ức chế RNase bao gồm các nhân tố ức chế protein của RNase các phức hợp vanadyl-ribonucleoside hoặc macaloid. - Nguyên lý. Phương pháp tách chiết RNA tổng số bao gồm các bước cơ bản giống như tách chiết DNA. Tế bào hoặc mô được nghiền trong dung dịch có chứa chất tẩy mạnh là SDS sodium dodecyl sulphate sarcocyl ở nồng độ cao các dung dịch muối mạnh guanidinium thiocyanate-GTC để hòa tan RNA và kết tủa các protein bị biến tính ở cùng một thời gian và một chất khử b-mercaptoethanol . Hai loại chất sau có tác dụng ức chế các RNase nội bào và tách các protein liên kết khỏi phân tử RNA. Bên cạnh đó có thể bổ sung các protease chẳng hạn protease K để gây biến tính các thành phần protein của phức chất RNA-protein. Các protein được loại bỏ khỏi mẫu bằng cách chiết ly tâm với phenol phenol chloroform và chloroform. RNA hòa tan trong pha nước được kết tủa bằng ethanol hoặc isopropanol và được thu nhận lại qua ly tâm. RNA được bảo quản trên một năm ở -70oC trong nước có chứa RNasin nhân tố ức chế RNase . . Phân lập RNA poly A RNA tổng số của tế bào chứa khoảng 90-99 rRNA và tRNA trong đó rRNA chiếm khoảng 80-85 và tRNA chiếm khoảng 15-20 . Các RNA này có kích thước và trình tự xác định và có thể được tách riêng dễ dàng bằng điện di hoặc ly tâm. Riêng mRNA chỉ chiếm khoảng 1-5 RNA tổng số của tế bào lại có kích thước và trình tự rất đa dạng. Tuy nhiên chúng có một điểm chung là cấu trúc đuôi polyA có thể lên tới 100A . Dựa vào cấu trúc này và đặc tính liên kết bổ sung A-T của