tailieunhanh - Chương 3: Khuếch đại in vitro DNA bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR)

PCR (polymerase chain reaction) là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử, đánh dấu một bước tiến vô cùng quan trọng tương đương với việc khám phá ra các enzyme hạn chế (xem chương 1) và kỹ thuật Southern blot. | Chương 3 Khuếch đại in vitro DNA bằng phản ứng chuỗi polymerase PCR PCR polymerase chain reaction là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử đánh dấu một bước tiến vô cùng quan trọng tương đương với việc khám phá ra các enzyme hạn chế xem chương 1 và kỹ thuật Southern blot xem chương 5 . PCR dựa trên cơ sở phản ứng kéo dài primer nhờ enzyme Taq polymerase để khuếch đại in vitro các nucleic acid đặc hiệu trong thiết bị điều nhiệt tuần hoàn thermocycler còn gọi là máy PCR Hình . PCR cho phép khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn DNA có chiều dài từ bp. Đoạn DNA được khuếch đại DNA đích được nhận dạng nhờ cặp primer đặc hiệu oligonucleotide thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide. Hình . Thiết bị điều nhiệt tuần hoàn I. Nguyên tắc của PCR Taq polymerase xem chương 1 là một loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt có ở vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus được dùng để tổng hợp các đoạn DNA mới trong môi trường có bốn loại deoxyribonucleotide dATP dCTP dGTP và dTTP và hai primer trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạn DNA nhất định đã biết hoặc chưa biết trình tự. Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn mẫu. Sau nhiều chu kỳ số lượng đoạn DNA nói trên được nhân lên gấp nhiều lần nhờ vậy có thể đủ số lượng để tách ra phân tích trình tự hoặc tạo dòng. Primer ở bên trái tác động trên sợi DNA 3 -5 được gọi là primer thuận forward primer ký hiệu là F . Primer ở bên phải tác động trên sợi DNA 5 -3 được gọi là primer ngược reverse primer ký hiệu là R . Nguyên tắc của PCR được trình bày trong hình và . Theo đó từ chu kỳ thứ hai Taq DNA polymerase gọi tắt là Taq pol bắt đầu tạo ra các đoạn DNA có chiều dài xác định. Các primer thường là một oligonucleotide tổng hợp synthetic oligonucleotide có khoảng 10-20 nucleotide hoặc hơn. Nếu biết trình tự của đoạn gen cần khuếch đại thì có thể tổng hợp nhân tạo các primer tương ứng để thực hiện .