tailieunhanh - Các Thao tác PCR

Các Thao tác PCR 1. chuẩn bị: - Bật bếp nhiệt - Lấy eppendorf , đánh số thứ tự theo quy định, dùng kim tiêm vô trùng đục thủng 1 lổ nhỏ trên nắp tube 2. Lấy mẫu bệnh phẩm: - Post: lấy khoảng 50 – 70 con còn sống hoặc cố định trong cồn 950 . Dùng chẩn đoán WSSV, MBV, HPV thao tác cẩn thận không để nhiễm bệnh giữa các mẫu. - Mẫu tôm nuôi: lấy phần nhỏ mang của từ 10 – 15 con (tổng lượng không quá 1gr) dùng chẩn đoán WSSV, MBV, HPV Lấy mẫu RNA virus: TSV, YHV - Mẫu tơm giống: lấy khoảng 30-50 PL. | Các Thao tác PCR I. Các Thao tác PCR 1. chuẩn bị: - Bật bếp nhiệt - Lấy eppendorf , đánh số thứ tự theo quy định, dùng kim tiêm vô trùng đục thủng 1 lổ nhỏ trên nắp tube 2. Lấy mẫu bệnh phẩm: - Post: lấy khoảng 50 – 70 con còn sống hoặc cố định trong cồn 950 . Dùng chẩn đoán WSSV, MBV, HPV thao tác cẩn thận không để nhiễm bệnh giữa các mẫu. - Mẫu tôm nuôi: lấy phần nhỏ mang của từ 10 – 15 con (tổng lượng không quá 1gr) dùng chẩn đoán WSSV, MBV, HPV Lấy mẫu RNA virus: TSV, YHV - Mẫu tơm giống: lấy khoảng 30-50 PL - Mẫu tôm nuôi: lấy một phần nhỏ mang của 10-15 con (tổng lượng mẫu không qúa 200 microgram). - Tơm bố mẹ: lấy mẫu cuốn mắt, chn bị, hoặc chn bơi hoặc một phần mang. - Mẫu gip xc hoang d: lấy một phần mang các loại động vật này (tổng lượng mẫu không qúa 200 microgram). Mẫu đã cố định trong cồn cần thấm sạch qua giấy trước khi cho vào eppendorf. 3. Tách chiết thô DNA - Cho mẫu vào eppendorf thêm vào 300µl dung dịch tách chiết DNA(NaOH , SDS 0,125%) rồi dùng chày nghiền nhuyễn. Sau đó tiếp tục thêm 300 µl dung dịch tách chiết, tiếp tục nghiền cho đến khi mẫu được nghiền hoàn toàn. Lấy chày ra đậy nắp và chuyển sang bếp nhiệt trong 5 – 10 phút. Sau đó lấy ra và làm lạnh nhanh các ống nghiệm trong đá(tủ lạnh) trong vài phút (Mẫu được sốc nhiệt nhằm phá vở màng tế bào và phá huỷ hoạt tính sinh học của một số chất có trong dịch chiết gây ảnh hưởng đến phản ứng PCR). 4. Ly tâm - Ly tâm vòng/phút trong 5 phút. Sử dụng phần dịch nổi cho phân tích PCR hoặc giữ lạnh trong -200C. 5. Nạp Mẫu - Thêm 5 µl nước cất 2 lan vào mỗi tube(pcr kit) có sẳn, sau đó lấy 2 µl mẫu phần dịch nổi cho vào ứng với mỗi tube. Thay đầu cone mỗi lần vào mẫu. 6. Chạy PCR - Bật máy PCR, nhan che do chay chuong trinh đến khi máy hoàn tất – complete 7. Điện di - Lấy tube ra đem điện di: lấy 10 µl dung dịch loading buffer cho vào mỗi tube trộn đều, bơm 20 µl dung dịch từ tube đã trộn trên ra máng