tailieunhanh - Biểu hiện gen HIV-1 p24 ở cây thuốc lá chuyển gen lục lạp

Chuyển gen HIV-1 p24 vào lục lạp đã được thực hiện thành công ở cây thuốc lá V2 (Virginia TBE2). Bằng các kỹ thuật PCR và Southern blot, các gen chuyển được chứng minh đã hòa nhập vào đúng vị trí thiết kế trên lục lạp, giữa gen trnfM và trnG. Kết quả Western blot cho thấy gen HIV-1 p24 biểu hiện ở các dòng thuốc lá chuyển gen. Hàm lượng protein p24 được ghi nhận qua phân tích ELISA cho thấy tích lũy ở mức cao nhất là 6,3 % tổng protein hòa tan (total soluble protein - TSP), ở các lá gần ngọn, và thấp nhất là 1,7% TSP. Protein được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký lọc gel phân tử có độ tinh sạch là 9,694 lần, hiệu suất tinh sạch là 31,94%, tuy nhiên protein p24 mất hoạt tính nhiều sau khi tinh sạch. | Science & Technology Development, Vol 15, 2012 BIi 1000 bp phút, 72oC/2 phút ] 72oC/5 phút. Thành ph$n v t li u: - Nư c c t vô trùng Chu kỳ luân nhi t: 30 chu kỳ theo các bư c 13,8 µl Quy trình PCR khu ch ñ i ño n trình tC - 5 X GoTaq flexi buffer 5 µl ñ7c hi u trên 1000 bp - MgCl2 (2,5M) 2 µl Thành ph$n v t li u: - M%i xuôi (10 pmol) 1 µl - Nư c c t vô trùng - M%i ngư c (10 pmol) 1 µl - 10 X buffer 5 µl - dNTPs (10 mM) 1 µl - dNTPs (20 mM) 2 µl - AccuTaq 1 µl - DNA template 1 µl - M%i xuôi (10 pmol) 1 µl - GoTaq Polymerase 0,2 µl - DNA template 1 µl - Th tích cu i: 25 µl 38 µl Trang 53 Science & Technology Development, Vol 15, 2012 - M%i ngư c (10 pmol) 1 µl Phương pháp Southern blot không phóng x - DMSO 1 µl ñư c th c hi n d a trên quy trình c a McCabe 50 µl và cs (1997) [5]. DNA ñư c chi t tách t' lá - Th tích cu i theo b kit DNeasy c a QIAGEN (Đ c). Chu kỳ luân nhi t: 30 chu kỳ theo các bư c M0u DNA thu c lá (5µg DNA t&ng) ñư c sau: 98oC/30 giây [94oC/30 giây, 50-60oC/30 c t b ng enzym gi i h n BglII. Trên l c l p giây, 68oC/4 phút ] 68oC/10 phút. hoang d i s+ có kích thư c ño n c t có th lai S n ph!m PCR ñư c b o qu n " 4oC. v i probe là 3,5 kb và trên l c l p chuy n gen K t qu PCR ñư c ñi n di trên gel agarose là 5,8 kb. 0,8%, dung d ch ñ m TBE 1%, thang DNA H8n h p DNA sau khi c t ñư c ch y ñi n di chu!n 1 kb (Biolabs, Anh) [3,13]. trên gel agarose 0,8 % trong ñi n trư ng 25 V Phương pháp Southern blot qua ñêm (thang chu!n λ HindIII) và sau ñó Dùng m0u dò ñ c hi u có ñánh d u ñ phát ñư c chuy n lên màng lai Hybond (GE hi n trình t DNA c$n ki m tra thông qua lai HIV-1 P24 trnS ycf9 trnG Prrn Prrn TrbcL trmfM rps14 psaB TpsbA Healthcare). phân t . aada psaC Bglll Bglll Sơ ñ? 2. C u trúc gen bi n n p vào l c l p gi ñ nh và các v trí c t b ng enzyme c t gi i h n (rps14, trmfM, trnG, ycf9, trnS, psaB, psaC: các gen l p th thu c lá) M0u dò (probe) ñ c hi u .