tailieunhanh - Bài giảng Sinh học phân tử: Chương 7 - Nguyễn Hữu Trí

Bài giảng Sinh học phân tử: Chương 7 trình bày về kỹ thuật tạo dòng. Chương này trình bày những nội dung chính sau: Các công cụ sử dụng trong kỹ thuật tạo dòng, Restriction Enzyme (RE), vai trò sinh học của RE, restriction endonuclease, tạo dòng phân tử (molecular cloning), DNA tái tổ hợp, công cụ tạo dòng,. Mời các bạn tham khảo. | Chương 7 Kỹ thuật tạo dòng 3/24/2016 1 Nguyễn Hữu Trí Các công cụ sử dụng trong kỹ thuật tạo dòng Enzymes - cắt, nối nucleic acid Vector- tạo dòng phân tử PCR (Polymerase chain reaction) Giải trình tự DNA (DNA sequencing) Điện di (Electrophoretic separation) Phát hiện gene: DNA-Southern blotting; lai tại chỗ (in situ hybridization); kỹ thuật FISH; RNA- Northern blotting Pr-Western blotting; lai miễn dịch IHC (immunohistochemistry) • Tinh sạch • Sinh vật chuyển gene • • • • • • 3/24/2016 2 Nguyễn Hữu Trí 1 Restriction Enzyme (RE) • Được tìm thấy trong các loài vi khuẩn khác nhau là các endonuclease có khả năng thủy giải DNA mạch đôi ở những vị trí xác định. • Vi khuẩn sử dụng restriction enzyme để bảo vệ chúng khỏi các DNA ngoại lai. • Vi khuẩn có một cơ chế để bảo vệ DNA của chúng khỏi hoạt động của các restriction enzyme của bản thân. • Các RE hợp thành hệ thống bảo vệ ở prokaryote, chưa có hệ thống tương tự nào được phát hiện ở eukaryote. • Chúng được phân lập và sử dụng cho các phòng thí nghiệm 3/24/2016 3 Nguyễn Hữu Trí Vai trò sinh học của RE • Hệ thống biến đổi giới hạn-restriction enzyme được hoạt động cùng với hệ thống methylase. • Methylases là enzyme thêm nhóm methyl vào nucleotide chuyên biệt (vào A hay C) trong trình tự nhận biết (recognition sequence). Sự methyl hóa ngăn chặn sự nhận biết của restriction enzyme. • Do đó, restriction enzyme trong một tế bào không phân cắt DNA của chính nó. Tuy nhiên restriction enzyme có thể phân cắt DNA ngoại lai xâm nhập vào trong tế bào như của bacteriophage. 3/24/2016 4 Nguyễn Hữu Trí 2 Restriction Endonuclease Loại I- có nhiều tiểu đơn vị,có hoạt tính endonuclease và methylase, cắt một cách ngẫu nhiên tại vị trí cách vị trí nhận biết (recognition sequence) 1000 bp Loại II- cắt DNA ngay vị trí nhận biết, không cần ATP, hầu hết ở dạng đơn phân Loại III- có nhiều tiểu đơn vị, có hoạt tính endonuclease và methylase cắt cách 25 bp từ trình tự nhận biết. 3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí 5 Restriction