Đang chuẩn bị liên kết để tải về tài liệu:
Luận văn : Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của ba giống bông vải Coker 312 và VN36P bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens part 3

Sau khi bảo hòa qua đêm, hạt tiếp tục được khử trùng bằng HgCl2 0,1% có vài giọt Tween 20 (thực hiện 2 lần mỗi lần 5 phút). Sau đó những hạt nứt nanh được bóc vỏ trong đều kiện vô trùng và cấy vào môi trường nảy mầm MSG (phụ lục 1) và nuôi ở nhiệt độ 28 290C, độ ẩm tương đối bằng 50%. Sau 5-7 ngày ta loại bỏ những keo bị tạp nhiễm, chọn những cây không bị tạp nhiễm làm nguồn vật liệu thí nghiệm. Từ cây mầm in vitro 5 - 7 ngày tuổi. | 19 Sau khi bảo hòa qua đêm hạt tiếp tục được khử trùng bằng HgCl2 0 1 có vài giọt Tween 20 thực hiện 2 lần mỗi lần 5 phút . Sau đó những hạt nứt nanh được bóc vỏ trong đều kiện vô trùng và cấy vào môi trường nảy mầm MSG phụ lục 1 và nuôi ở nhiệt độ 28 -290C độ ẩm tương đối bằng 50 . Sau 5-7 ngày ta loại bỏ những keo bị tạp nhiễm chọn những cây không bị tạp nhiễm làm nguồn vật liệu thí nghiệm. Từ cây mầm in vitro 5 - 7 ngày tuổi đã được nuôi cấy các trụ hạ diệp được cắt thành những đoạn dài khoảng 0 5 cm dùng làm vật liệu cho nghiên cứu chuyển nạp gen. Hình 3.1. Hạt bông vải sau khi tách vỏ và cấy vào môi trường nảy mầm Hình 3.2. Cây mần in vitro 5 ngày tuổi. 20 3.4.2. Quy trình chuyển nạp gen 3.4.2.1. Nguồn plasmid Nguồn plasmid được sử dụng để nghiên cứu là vector pManCa Hoa và Bong 2003 mang gen pmi phosphomannose isomerase giúp tế bào vi khuẩn biến dưỡng đường mannose và gen chỉ thị gus trong chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 Hoekema và ctv 1983 . CaMV35S I CaMV35S LB pwF llacZalpha giis RB I -------- I Xhol xhol Ncol BaniHI Sơ đo vector pMauCa inaug genjJWii Hình 3.3. Sơ đồ vector pManCa mang gen pmi và gen gus 3.4.2.2. Chuẩn bị vi khuẩn Chủng vi khuẩn LBA4404 mang vector pManCa từ ống tồn trữ trong glycerol 50 v v ở nhiệt độ -800C được nuôi cấy trên môi trường đặc ABG Chilton và ctv 1974 có 50 mg l kanamycin và ủ ở 280C trong 72 giờ. Trên môi trường đặc ABG phụ lục 4 chọn một khuẩn lạc phát triển tốt đem nuôi cấy trong 3ml môi trường lỏng YEP An và ctv 1988 có bổ sung 50mg l kanamycin và nuôi qua đêm 24-28 giờ ở 280C trên máy lắc với tốc độ 200vòng phút. Sau khi nuôi cấy 24-28 giờ cấy chuyền sang 50 ml môi trường YEP phụ lục 5 có kanamycin 50mg l và nuôi cấy khoảng 16- 18 giờ ở 280C lắc 200 vòng phút đến khi OD600 đạt khoảng 0 5 - 1. 3.4.2.3. Lây nhiễm đồng nuôi cấy Chủ yếu dựa theo quy trình của Chen và ctv 2000 US Patent số WO 00 77230 A1 với một vài thay đổi OD600 pha loãng là 0 5 thời gian ngâm mẫu trong dịch vi khuẩn là 30 phút và lây .