Đang chuẩn bị liên kết để tải về tài liệu:
Giáo trình DNA tái tổ hợp part 8

2. Phương pháp enzyme Sanger Đây là phương pháp tạo đầu tận cùng của chuỗi (chain terminator method). Nguyên lý của phản ứng này là sử dụng dideoxynucleotide không có nhóm OH ở vị trí 3’ trong phản ứng tổng hợp DNA. Do đó, khi DNA polymerase gắn chúng vào sợi DNA thì quá trình tổng hợp bị ngừng lại. Vì vậy, phương pháp này còn gọi là phương pháp dideoxy (dideoxy method). Đầu tiên sợi đôi DNA (sợi khuôn cần đọc trình tự) bị biến tính tách thành hai sợi đơn và được lai với primer. . | 2. Phương pháp enzyme Sanger Đây là phương pháp tạo đầu tận cùng của chuỗi chain terminator method . Nguyên lý của phản ứng này là sử dụng dideoxynucleotide không có nhóm OH ở vị trí 3 trong phản ứng tổng hợp DNA. Do đó khi DNA polymerase gắn chúng vào sợi DNA thì quá trình tổng hợp bị ngừng lại. Vì vậy phương pháp này còn gọi là phương pháp dideoxy dideoxy method . Đầu tiên sợi đôi DNA sợi khuôn cần đọc trình tự bị biến tính tách thành hai sợi đơn và được lai với primer. Primer là một sợi đơn gồm vài chục nucleotide có thể liên kết với một trong hai sợi đơn DNA theo nguyên tắc tạo cặp bổ sung. Sau đó bốn phản ứng riêng rẽ được tiến hành đồng thời. Mỗi phản ứng là hỗn hợp của DNA khuôn mẫu primer DNA polymerase một loại dideoxynucleotide và bốn loại deoxynucleotide theo tỷ lệ 1 100. Các sợi đơn DNA được tổng hợp có độ dài khác nhau do dideoxynucleotide gắn ngẫu nhiên làm dừng phản ứng. Sản phẩm của bốn phản ứng cùng được phân ly trên polyacrylamide gel cho phép phân biệt hai sợi đơn DNA hơn kém nhau một nucleotide. Các vạch DNA quan sát được nhờ có gắn phóng xạ 32P vào mồi hoặc vào một trong bốn loại loại nucleotide bình thường Hình 5.13 . 3. Xác định trình tự nucleotide trên máy tự động Trong những năm gần đây một số phương pháp xác định trình tự mới đã xuất hiện. Bên cạnh kỹ thuật thông thường sử dụng các gel để phân ly các phân tử DNA có độ dài khác nhau các kỹ thuật mới liên quan đến phát hiện huỳnh quang của các nucleotide được đánh dấu phân tích trình tự DNA bằng khối phổ điện di mao quản hoặc lai với các đoạn oligonucleotide được tổng hợp nhân tạo. Những tiến bộ nhanh chóng trong lĩnh vực kính hiển vi điện tử cho phép quan sát chi tiết cấu trúc bề mặt của phân tử nucleic acid và phân biệt từng nucleotide. Ngoài ra kỹ thuật lai sử dụng tấm chip gắn cố định các oligonucleotide cho phép phân biệt được hơn 50.000 phân tử DNA khác nhau. Trong tương lai gần kỹ thuật lai này có thể gắn hàng nghìn oligo trên một tấm chip nhỏ và trình tự nucleotide được phân tích tự